Sekonder antikor seçerken aşağıdaki hususlar yardımcıdır:

1. Birincil antikorun konakçı türünü belirleyin, yani sekonder antikorun tepki verdiği türü (örneğin, Rabbit anti-MS2 monoklonal antikor için, birincil antikorun konakçı türü tavşandır).

2. Sekonder antikor için uygun bir konakçı türü seçin (örneğin, Keçi Anti-Fare IgG, burada sekonder antikorun konakçı türü keçidir).

3. Sekonder antikorun çapraz reaktivitesini veya özgüllüğünü ve çapraz adsorbe edilip edilmediğini göz önünde bulundurun.
4. Çoklu etiketleme uygulamaları için kullanılacağı veya örneğin endojen antikorlar içerip içermediğini göz önünde bulundurun.
5. Özgüllük: Birincil antikorun sınıfına veya fragmanına doğru şekilde bağlandığından emin olun.
6. Tespit yöntemine göre uygun konjugatı seçin.

Sekonder antikorlar, birincil antikorun türüne karşı üretilir. Bu nedenle, birincil antikorunuzun konakçı türünden farklı bir türde üretilmiş bir sekonder antikor ihtiyacınız vardır. Örneğin, birincil antikorunuz tavşanda üretilmişse, tavşan dışı bir konakçı türünde (örneğin, keçi, fare vb.) üretilmiş bir anti-tavşan sekonder antikoruna ihtiyacınız olacaktır.

Önerilen antikor seyreltmesi/konsantrasyon değerlerimizin bazıları, antikor geliştirme sırasında yapılan deneylerden veya işbirliği yaptığımız kuruluşların ve diğer müşterilerin deneyimlerine dayanmaktadır. Örneklerin veya deney koşullarının farklılıklarından dolayı, belirli deneyinizde en iyi şekilde çalışmayabilir. Önerimiz size işe yaramazsa, lütfen birkaç farklı seyreltme/konsantrasyonu test etmeyi deneyin.

Keçi Anti-Fare IgG (H+L), birkaç kalite ile mevcuttur ve IgG ile IgM antikorları arasında bazı dizi benzerlikleri vardır. Bu nedenle, çapraz adsorbe edilmemiş Keçi Anti-Fare IgG (H+L), fare IgM antikorlarıyla bir dereceye kadar çapraz reaktivite gösterebilir. IgM antikorlarıyla çapraz reaktivitenin tamamen olmamasını gerektiren durumlar için, Keçi Anti-Fare IgG1, Keçi Anti-Fare IgG2a, Keçi Anti-Fare IgG2b vb. antikorlardan seçim yapabilirsiniz.

Keçi Anti-Fare IgG (H+L), IgG3 dahil fare IgG'nin tüm alt sınıflarına bağlanacaktır.

This antibody has not been cross-adsorbed against rat IgG, and we do not have extensive information on this. However, considering that the antibody in question is polyclonal, this possibility cannot be ruled out.

Keçi Anti-Fare IgG (H+L) için immünojen hem ağır hem de hafif zincirleri içerir. Hafif zincir kappa veya lambda olabilir. Bu nedenle, bu antikor, kappa zincirleri taşıyan birincil antikorlarla reaksiyona girecek, ancak yalnızca kappa zincire özgü değildir.

İki farklı konjugat ile etiketlenmiş bir antikor, aynı örnek üzerinde hem kromojenik hem de floresan görüntülemeyi mümkün kılar. Bu nedenle, çok模态li (multimodal) çalışmalar mümkündür ve bu amaçla özel etiketleme sunabiliriz.

Sekonder antikorlar birincil antikorlara bağlanır. Bu nedenle, bir sekonder antikorun uygulama yelpazesi birincil antikorla daha yakından ilişkilidir. Bir birincil antikor belirli immünotestlerde kullanılabiliyorsa, sekonder antikor da tipik olarak kullanılabilir. Sonuç olarak, nihai uygulama kapsamı öncelikle birincil antikorun uygulama aralığına, sekonder antikor etiketi türüne ve sinyal çıktı sistemine bağlıdır.

Tüm floroforlar, absorpsiyon dalga boylarındaki yoğun ışığa maruz kaldıklarında bir dereceye kadar solmaya veya "fotoğermeye" uğrarlar. Olası çözümler şunlardır:

1. Fluor boyaları gibi daha foto kararlı boyalar seçin.
2. Kontrollü boyama ve görüntü alanını esnek bir şekilde ayarlayın, ardından hedef boyama için görüntüleme yapın.
3. Örneğin lazer gücünü azaltarak veya nötr yoğunluk filtreleri kullanarak maruz kalma süresini ve şiddetini azaltın.
4. Etiketli örneklerin gözlem süresini mümkün olduğunca kısa tutun ve görüntülemediğinizde perdeyi kapatın.
5. Düşük güçlü objeler gibi düşük sayısal açıklığa sahip objeler kullanın.

Klasik ELISA sistemi genellikle bir avcı antikor ve bir tespit antikorundan oluşan sandviç test formatı kullanır. Her iki antikor da fare monoklonal antikorlarıysa, HRP-etiketli Keçi Anti-Fare IgG her ikisine de bağlanır ve testi spesifik olmayan hale getirir. Bu nedenle, ELISA sisteminde, avcı antikorun konakçı türü fare olmamalıdır, buna karşılık tespit antikorunun fare kökenli olması gerekir. Ayrıca, tespit edilen örnek türünün fare IgG'si veya benzeri moleküller içermemesi gerekir.

Çok renkli immünofloresan için farklı floroforlarla konjuge edilmiş sekonder antikorlar kullanmak mümkündür, ancak dikkatli tasarım ve düşünce gerektirir:

1. Florofor Seçimi: Uyarma ve emisyon spektrumlarının mümkün olduğunca ayrı olduğu floroforlar seçin. Azaltılmış spektral örtüşme, çapraz iletişim (kanal karışıklığı) olasılığını azaltır. Geniş aralıkta yayılmış emisyon tepitlerine sahip boya kombinasyonlarına tercih verin (örneğin, Fluor488, Fluor555 ve Fluor647 kombinasyonu çok klasiktir).
2. Aygıt Uyumluluğu: Seçtiğiniz floroforların laboratuvarın mikroskobu veya görüntüleme sisteminin lazerleri ve filtre setleri tarafından etkili bir şekilde uyarılabileceğini ve tespit edilebileceğini sağlayın. Boyalar seçmeden önce aygıt konfigürasyon kılavuzuna başvurun.
3. Parlaklık ve Ekspresyon Seviyesi Eşleştirme: En parlak floroforları (örneğin, Fluor647, Cy5) düşük abundance'lı hedef proteinlere atayın. Daha soluk floroforları (örneğin, FITC, Cy2) yüksek abundance'lı hedef proteinlere atayın. Bu, kanallar arasında sinyal yoğunluklarını dengelemek, güçlü sinyallerin zayıf olanları maskesini engellemek için yardımcı olur.
4. Sekonder Antikor Spesifikliği ve Çapraz Adsorpsiyon: Bu, spesifik olmayan çapraz reaktivitenin önlenmesi için çok önemlidir ve sonuçların güvenilirliğini doğrudan etkiler. Çapraz adsorbe edilmiş sekonder antikorlar seçmelisiniz. Bu, antikorun başka türlerden immünoglobulinlerle çapraz reaksiyona girebilecek antikorları çıkarmak için saflaştırıldığı anlamına gelir. Örneğin, hem fare hem de sıçan birincil antikorlar kullanıyorsanız, anti-fare sekonder antikorunuz sıçan serum proteinlerine karşı çapraz adsorbe edilmelidir ve bunun tersi de geçerlidir. Bu, sekonder antikorun yalnızca belirli hedef birincil antikoruna bağlandığını ve diğer türlerden birincil antikorlarla çapraz reaksiyon vermediğini garanti eder.
5. Konakçı Türü: Tüm sekonder antikorlar aynı konakçı türünden elde edilmelidir (örneğin, tümü keçi kökenli). Bu, sekonder antikorların birbirini tanıması ve bağlanmasını engeller (örneğin, anti-tavşan sekonderin yanlışlıkla anti-fare sekonderine bağlanması), bu da yanlış pozitiflere neden olur.
6. Deney Tasarımı ve Kontroller: Uygun kontroller olmadan, çok renkli deney sonuçları yorumlanması güç olabilir. Tek boya kontrolleri esastır. Her deney için, yalnızca bir birincil/sekonder antikor çiftiyle boyanmış örnekleri dahil edin, diğer kanallar ise yalnızca sekonder antikor seyreltme çözeltisi (veya hiçbir birincil) alır. Bu kontrolleri, gerçek görüntü edinme ayarlarınız altında her kanalda çapraz iletişimi kontrol etmek için kullanın. Boş Kontrol: Tüm birincil antikorları atlayın, yalnızca sekonder antikor karışımı ile inkübe edin, sekonderlerin spesifik olmayan bağlanmasını tespit etmek için. Sıralı İnkübasyon: Farklı türlerden birincil antikorların önce ayrı ayrı inkübe edilmesi, ardından karşılık gelen tür spesifik sekonder antikorların bir karışım olarak inkübe edilmesi önerilir. Bu, tüm birincilleri karıştırıp sonra tüm sekonderleri karıştırmaya kıyasla çapraz reaksiyon riskini azaltabilir.
7. Antikor Konsantrasyonu Optimizasyonu (Titrasyon): Kullanimdan önce her antikor çiftini titre ederek en yüksek sinyal-gürültü oranını veren optimal konsantrasyonu bulmaya özen gösterin. Aşırı yüksek antikor konsantrasyonları arka planı ve spesifik olmayan bağlanmayı artırır.
8. Görüntü Edinme ve İşleme: İyi yürütülen bir deney olsa bile, uygun olmayan görüntü edinme sonuçları bozabilir. Tüm kanalların eşzamanlı olarak uyarılması ve edinilmesini kaçının. Edinme dizisini, her kanalın ayrı ayrı (sıralı olarak) uyarılması ve yakalanması için ayarlayın. Bu, edinme sırasında kanallar arasındaki çapraz iletişimi tamamen ortadan kaldırır. Spektral Ayrıştırma: Aygıtınızda bu yetenek varsa (örneğin, bazı konfokal mikroskoplar), yüksek oranda örtüşen spektral floresan sinyallerini etkili bir şekilde ayırabilir ve çok renkli deneyler için güçlü bir araçtır. Son İşleme: Küçük çapraz iletişim tespit edildiyse, yazılım bazen spektral ayrıştırma hesaplamaları için kullanılabilir, ancak en iyi yaklaşım, deney tasarım aşamasında çapraz iletişimi önlemektir.