ELISA Sorun Giderme Kılavuzu
Problem: Yüksek Arka Plan
| Olası Kaynak | Test veya Aksiyon |
|---|---|
| Yetersiz yıkama | Yıkama sayısını artırın; yıkama aralarında 30 saniye bekletme adımı ekleyin |
Problem: Beklenen sinyal olmadığında sinyal yok
| Olası Kaynak | Test veya Aksiyon |
|---|---|
| Reaktifler yanlış sırada eklendi veya yanlış hazırlandı | Deneyi tekrarlayın; hesaplamaları kontrol edin ve yeni bufferlar, standartlar vb. yapın. Protokolü gözden geçirin |
| HRP kontamineli | Taze reaktifler kullanın |
| Yeterli antikor kullanılmadı | Konsantrasyonu artırın |
| Standart bozulmuş (eğer örnek kuyularında sinyal varsa) | Standardın talimatlara göre işlendiğini kontrol edin. Yeni şişe kullanın. |
| Antikorları yeniden çözmek için FCS içeren buffer kullanıldı | Seçtiğiniz reaktifleri yeniden doğrulayın |
| Yakalama antikoru plaka bağlanmadı | ELISA plakası kullanın (doku kültürü plakası değil) İlave protein olmadan PBS'de seyreltin |
| Bufferlar kontamineli | Taze bufferlar hazırlayın |
Problem: Çok fazla sinyal - tüm plaka düzenli maviye döndü
| Olası Kaynak | Test veya Aksiyon |
|---|---|
| Yetersiz yıkama/yıkama adımı atlandı - bağlanmamış peroksidaz kaldı | Adımlar arasında kapsamlı yıkama yaptığınızdan emin olun. |
| Substrat Çözeltisi çok erken karıştırıldı ve maviye döndü | Substrat Çözeltisi karıştırılmalı ve hemen kullanılmalıdır |
| Çok fazla streptavidin-HRP | Seyreltmeyi kontrol edin, gerekirse titre edin |
| Plaka mühürleri veya reaktif depoları yeniden kullanıldı, bu da kalıntı HRP varlığına neden olur. Bu TMB'yi spesifik olmayan şekilde maviye çevirir | Her adım için taze plaka mühürü ve reaktif deposu kullanın |
| Bufferlar metal veya HRP ile kontamineli | Taze bufferlar hazırlayın |
Problem: Standart eğri elde edildi ancak noktalar arası ayrım zayıf (düşük veya düz eğri)
| Olası Kaynak | Test veya Aksiyon |
|---|---|
| Yetersiz streptavidin-HRP | Seyreltmeyi kontrol edin, gerekirse titre edin |
| Yakalama antikoru plakaya iyi bağlanmadı | ELISA plakası kullanın (doku kültürü plakası değil) İlave protein olmadan PBS'de seyreltin |
| Yetersiz tespit antikoru | Seyreltmeyi kontrol edin, gerekirse titre edin |
| Plaka yeteri kadar geliştirilmedi | Substrat Çözeltisi inkübasyon süresini artırın Önerilen Substrat Çözeltisi markasını kullanın |
| Yanlış prosedür | Genel ELISA Protokolüne geri dönün; varsa değişiklikleri ortadan kaldırın |
| Standart eğri seyreltmelerinin yanlış hesaplanması | Hesaplamaları kontrol edin, yeni standart eğri oluşturun |
Problem: Kötü Kopyalar
| Olası Kaynak | Test veya Aksiyon |
|---|---|
| Yetersiz yıkama | Otomatik plaka yıkayıcı kullanıyorsanız, tüm portların temiz ve engelsiz olduğunu kontrol edin, 30 saniye bekletme adımı ekleyin ve yıkama sırasında plakayı ortada çevirin |
| Prosedürel hata veya kötü plaka kalitesi nedeniyle düzensiz plaka kaplanması (düzensiz bağlanabilir) | İlave protein olmadan PBS'de seyreltin Kaplanma ve bloklama hacimlerini, sürelerini ve reaktif ekleme yöntemini kontrol edin. Kullanılan plakayı kontrol edin ELISA plakası kullanın (doku kültürü plakası değil) |
| Plaka mührü yeniden kullanıldı | Her adım için taze plaka mührü kullanın |
| Plaka mührü kullanılmadı | Plaka mühürleri kullanın |
| Bufferlar kontamineli | Taze bufferlar hazırlayın |
Problem: Deneyden Deneye Zayıf Tekrarlanabilirlik
| Olası Kaynak | Test veya Aksiyon |
|---|---|
| Yetersiz yıkama | Otomatik plaka yıkayıcı kullanıyorsanız, tüm portların temiz ve engelsiz olduğunu kontrol edin |
| İnkübasyon sıcaklığındaki değişiklikler | Önerilen inkübasyon sıcaklığına uyun Plakaları çevresel koşulların değişken olduğu alanlarda inkübe etmekten kaçının |
| Protokollerdeki değişiklikler | Deneyden deneye aynı protokole uyun |
| Plaka mührü yeniden kullanıldı, bu da kalıntı HRP varlığına neden olur ve TMB'yi maviye çevirir | Her adım için taze plaka mührü kullanın |
| Standart eğri seyreltmelerinin yanlış hesaplanması | Hesaplamaları kontrol edin, yeni standart eğri oluşturun İç kontrolleri kullanın |
| Bufferlar kontamineli | Taze bufferlar hazırlayın |
Problem: Sinyal Beklenirken Sinyal Yok, Ancak Standart Eğri Normal Görünüyor
| Olası Kaynak | Test veya Aksiyon |
|---|---|
| Örnekte sitokin yok | İç kontrolleri kullanın Deneyi tekrarlayın, deneysel parametreleri yeniden değerlendirin |
| Örnek matrisi tespiti maskeliyor | Örnekleri uygun seyrelticinde en az 1:2 oranında seyreltin veya tercihen kurtarımı görmek için bir dizi seyreltme yapın |
Problem: Örnekler Çok Yüksek Okuma Veriyor, Ancak Standart Eğri Normal Görünüyor
| Olası Kaynak | Test veya Aksiyon |
|---|---|
| Örnekler deney aralığının üzerinde sitokin seviyeleri içeriyor | Örnekleri seyreltin ve tekrar çalıştırın |
Problem: Plaka Genelinde Çok Düşük Okuma Değerleri
| Olası Kaynak | Test veya Aksiyon |
|---|---|
| Yanlış dalga boyları | Filtreleri/okuyucuyu kontrol edin |
| Yetersiz geliştirme süresi | Geliştirme süresini artırın |
| Kaplanmış plakalar eski ve bozulmuş | Yeni plakaları kaplayın |
| Yakalama antikoru plakaya bağlanmadı | ELISA plakası kullanın (doku kültürü plakası değil) İlave protein olmadan PBS'de seyreltin |
| Antikorları yeniden çözmek için FCS içeren buffer kullanıldı | Seçtiğiniz reaktifleri yeniden nitelendirin |
Problem: Streptavidin-HRP Kullanırken Durdurma Çözeltisi Eklendiğinde Yeşil Renk Gelişir
| Olası Kaynak | Test veya Aksiyon |
|---|---|
| Reaktifler kuyularda yeterince karıştırılmamış | Plakayı vurun |
Problem: Kenar Etkileri
| Olası Kaynak | Test veya Aksiyon |
|---|---|
| Çalışma yüzeyi etrafındaki eşit olmayan sıcaklıklar | Plakaları çevresel koşulların değişken olduğu alanlarda inkübe etmekten kaçının |
| Plaka mühürleri kullanın |
Problem: Kayma
| Olası Kaynak | Test veya Aksiyon |
|---|---|
| Kesintiye uğrayan deney kurulumu | Deney kurulumu sürekli olmalıdır - deney başlamadan önce tüm standartları ve örnekleri uygun şekilde hazırlayın |
| Reaktifler oda sıcaklığında değil | Kuyulara pipetlemeden önce tüm reaktiflerin oda sıcaklığında olduğundan emin olun, antikor ekleri başka türlü talimat vermediği sürece |