ELISA işlem adımları

Operasyonel süreç

• Kaplayıcı antikor: Kaplayıcı antikor'u deneysel ihtiyaçlara göre karbonat tamponu (CBS) veya fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS) kullanarak gerekli seyreltmeye seyreltin. Kuyuya 100 μL kaplayın, 37°C'de 2 saat veya 4°C'de gece boyunca inkübe edin.
• Kuyulardaki sıvıyı atın, kurutun, plakayı 10 mM PBST (10 mM PBS + %0.05 Tween-20) ile iki kez yıkayın, her seferinde 1-2 dakika bekletin, kuyu başına 350 μL, ve kurutun (ayrıca kuyulardaki sıvıyı çıkarmak için nazikçe vurabilirsiniz).
• %1 BSA veya %5 yağsız süt içeren 10 mM PBST (10 mM PBS + %0.05 Tween-20) ile %1 BSA veya %5 yağsız süt ile kapatın, kuyu başına 350-400 μL kullanarak, 37°C'de 2 saat.
• Plakayı yıkayın: 2. adımı takip edin.                Not: Ticari kitler genellikle ELISA plakalarında yakalayıcı antikorlar ile önceden kaplanmış olarak gelir, bu nedenle 1-4 adımları genellikle gereksizdir. Lütfen kullanmadan önce doğrulayın.
• Örnekleri ekleyin: Sıfır kuyularını, standart kuyularını ve örnek kuyularını ayarlayın. Boş kuyulara 100 μL örnek seyrelticisi ekleyin ve kalan kuyulara 100 μL standart veya örnek ekleyin                Not: köpüklerden kaçının, örneği kuyunun altına ekleyin, kuyu duvarına dokunmamaya çalışın ve bir plakadaki örnek eklemelerini 10 dakika içinde tamamlayın.                Enzime bağlı immunosorbent assay (ELISA) plakasını bir kapak veya film ile örtün ve 37°C'de 60-120 dakika inkübe edin. Deneysel sonuçların geçerliliğini sağlamak için lütfen her deney için yeni bir standart çözelti kullanın.
• Kuyulardaki sıvıyı atın, kurutun, plakayı 10 mM PBST (10 mM PBS + %0.05 Tween-20) ile 4 kez yıkayın, her seferinde 1-2 dakika bekletin, kuyu başına 350-400 μL kullanın, ve kurutun (ayrıca kuyulardaki sıvıyı çıkarmak için nazikçe vurabilirsiniz).
• Tespit antikoru ekleyin: Deneysel gereksinimlere göre tespit antikor'unu PBST ile belirli bir seyreltmeye seyreltin, kuyu başına 100 μL, 37°C'de 1 saat.
• Plakayı yıkayın: 6. adım gibi.
• İkincil antikor ekleyin: İkincil antikor'u 10 mM PBST ile gerekli seyreltmeye seyreltin, kuyu başına 100 μL ekleyin, 37°C'de 1 saat inkübe edin.
• Plakayı yıkayın: 6. adım gibi.
• TMB ekleyin: Her kuyuya 100μL TMB substrat çözeltisi ekleyin, aşırı renk gelişimini önlemek için deneysel gereksinimlere göre süreyi ayarlayarak 37°C'de karanlıkta 10-30 dakika inkübe edin.
• Durdurma çözeltisi ekleyin: Renk gelişimi beklenen seviyeye ulaştığında (standart kuyularda gradyan renk göründüğünde gibi), enzim reaksiyonunu sonlandırmak için her kuyuya 50μL durdurma çözeltisi (örneğin 2M sitrik asit) ekleyin (bu noktada mavi renk sarıya dönüşür).
• Enzime bağlı immunosorbent assay (ELISA) okuma: Kalibrasyon dalgaboyu olarak 630 nm kullanarak, ELISA okuyucusu ile her kuyunun absorbansını (OD değeri) sırasıyla 450 nm'de ölçün. Durdurma çözeltisini ekledikten sonra değerleri 5 dakika içinde okuyun.